Comprensione dei meccanismi molecolari dell’azione della metformina.

Il meccanismo d'azione della metformina nel mitigare il diabete non è certo, ma un percorso plausibile deriva dalla sua debole inibizione del complesso respiratorio mitocondriale I, che attiva la proteina chinasi attivata dall'AMP (AMPK) a causa della ridotta sintesi di ATP. 

L'attivazione dell'AMPK riduce la produzione di glucosio nel fegato dei diabetici insulino-resistenti e stimola la biogenesi mitocondriale. Altri studi sollevano la possibilità di diversi meccanismi. Ad esempio, un dimero di metformina chiamato supformina mostra attività chelanti del rame superiori e media forti effetti antinfiammatori.

Altri possibili meccanismi includono una riduzione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) a causa di una catena respiratoria parzialmente indebolita e il diminuito rilascio di fattori dannosi per i tessuti da parte delle cellule senescenti (fenotipo secretorio associato alla senescenza o "SASP"), che porta a una diminuzione dell'infiammazione e a un ridotto accumulo di cellule senescenti.

Nell'uomo, la metformina può anche agire alterando il microbioma per aumentare l'abbondanza di ceppi batterici che producono gli acidi grassi a catena corta (SCFA) che promuovono la salute, butirrato e propionato.¹³  e un metabolita chiamato agmatina. 

Coerentemente con questa idea, l'iniezione orale ma non intraperitoneale di metformina è associata a cambiamenti nel microbioma intestinale e riduzioni della crescita delle cellule tumorali nei topi alimentati con una dieta ricca di grassi, un effetto che può essere ricapitolato dal trapianto fecale da topi trattati con metformina a topi non creati. 

Più recentemente, sono stati riscontrati anche cambiamenti nei livelli di espressione genica e nei fattori circolanti, tra cui il rilascio di peptide-1 simile al glucagone (GLP-1), GDF15 e MIC-1.

I primi studi hanno evidenziato che il fegato è il principale sito di azione della metformina per il controllo della produzione epatica di glucosio, attraverso meccanismi sia dipendenti dalla proteina chinasi attivata dall'AMP (AMPK) che indipendenti dall'AMPK.  

Tuttavia, ci sono prove crescenti che anche altri siti d'azione potrebbero essere importanti, tra cui: 

·     il tratto gastrointestinale,

·     il microbiota intestinale

·     le cellule immunitarie residenti nei tessuti.  

Inoltre, a causa delle sue modalità d'azione pleiotropiche, con molteplici siti d'azione e vie di segnalazione, il riposizionamento della metformina si sta espandendo per includere varie condizioni fisiopatologiche.  

Cambiamenti di paradigma nelle azioni di glucoregolazione

Organi bersaglio della metformina 

Apparato gastrointestinale: Tradizionalmente si ritiene che gli effetti antiiperglicemici della metformina derivino principalmente dagli effetti nel fegato; tuttavia, prove emergenti supportano il ruolo dei meccanismi extraepatici.

Negli ultimi anni, studi clinici condotti in individui con diabete di tipo 2 a recente insorgenza (durata del diabete di tipo 2 inferiore a 50 mesi) e in individui di controllo non diabetici hanno dimostrato un aumento associato alla metformina nella produzione endogena di glucosio, il che indica che l'azione ipoglicemizzante della metformina non è interamente governata da una riduzione della gluconeogenesi epatica.

Negli ultimi anni, il tratto gastrointestinale è stato al centro dell'attenzione come sito aggiuntivo o addirittura alternativo dell'azione della metformina nella gestione del diabete di tipo 2;

Sono stati proposti molteplici meccanismi, non necessariamente mutuamente esclusivi, tra cui azioni dirette del farmaco sulle cellule intestinali o alterazioni nella composizione e nel profilo metabolico del microbiota intestinale.  

In particolare, il ruolo dell'AMPK intestinale è stato evidenziato nelle azioni ipoglicemizzanti e metaboliche della metformina nei roditori.

È stato riportato un elevato accumulo di metformina nell'intestino con concentrazioni fino a 30-300 volte superiori rispetto al plasma e ad altri tessuti, suggerendo che l'intestino funge da importante serbatoio di metformina sia nell'uomo che nei modelli animali.  

L'ipotesi della "spugna" è stata proposta per spiegare l'assorbimento lento e dose-dipendente della metformina lungo il tratto gastrointestinale.

Siti cellulari

Nell'uomo, la metformina entra negli enterociti attraverso il trasporto apicale saturabile, ma il suo rilascio attraverso la membrana basolaterale è inefficiente a causa dell'assenza di trasportatori intestinali di efflusso, che sequestrano e concentrano il farmaco all'interno degli enterociti.  

Quindi, la metformina nel lume intestinale potrebbe subire un trasporto paracellulare prevalentemente saturabile attraverso l'intestino umano per accedere al sangue circolante.

La metformina inibisce l'assorbimento intestinale del glucosio alimentare nei roditori e nei minipig e nei pazienti con T2DM45.

Questo risultato è stato confermato dall'imaging PET-TC che mostra l'accumulo di fluorodesossiglucosio (FDG) marcato con 18F, un analogo del glucosio non metabolizzabile, nel lume intestinale dei ratti diabetici Goto-Kakizaki trattati con una singola dose orale di metformina.

L'inibizione dell'assorbimento intestinale del glucosio è derivata dalla diminuzione transitoria dell'abbondanza del trasportatore sodio-glucosio 1 (SGLT1) sulla membrana apicale degli enterociti nel digiuno.

La riduzione della risposta glicemica postprandiale mediata da una singola somministrazione di metformina è stata abrogata nei topi privi di SGLT1, ma non in quelli privi del trasportatore del glucosio 2 (GLUT2).

È interessante notare che l'efficacia ipoglicemizzante dopo una singola somministrazione di metformina nel digiuno dei minipig è stata combinata con una riduzione dell'assorbimento intestinale del glucosio e un aumento del rilascio del peptide 1 simile al glucagone (GLP1), suggerendo che l'assorbimento ritardato del glucosio intestinale e l'esposizione del glucosio a regioni più distali dell'intestino sono sufficienti per stimolare la secrezione di GLP1 dopo l'assunzione orale di glucosio.

In linea con questa osservazione, una singola somministrazione di metformina nell'intestino tenue prossimale e distale ha notevolmente attenuato la risposta glicemica al glucosio orale nei pazienti con diabete di tipo 2, in concomitanza con una maggiore secrezione di GLP1.

Sulla base delle osservazioni in pazienti con diabete di tipo 2 trattati con metformina, l'imaging PET-TC dopo somministrazione endovenosa di 18F-FDG, che entra negli enterociti attraverso GLUT2 basolaterale, ha mostrato che l'aumento dell'assorbimento di glucosio dalla circolazione nel sistema gastrointestinale contribuisce all'effetto ipoglicemizzante del farmaco e al miglioramento del controllo glicemico.

Allo stesso modo, l'imaging PET-TC 18F-FDG nei topi alimentati con una dieta ricca di grassi (HFD) ha confermato che l'assorbimento basolaterale del glucosio intestinale indotto dalla metformina è accompagnato da un miglioramento della tolleranza al glucosio, che si verifica in modo dose-dipendente.

Sfruttando le tecniche PET-MRI 18F-FDG di nuova concezione, è stato dimostrato un accumulo dose-dipendente indotto dalla metformina di 18F-FDG sia nella parete intestinale che nello spazio luminale dell'ileo e del colon dei partecipanti con T2DM che ricevono metformina, il che suggerisce che la metformina promuove anche il rilascio di glucosio dagli enterociti nello spazio intraluminale. Inoltre, dopo somministrazione orale acuta di 18F-FDG e metformina in topi alimentati con HFD, la PET con 18F-FDG ha mostrato un ridotto trasporto transepiteliale di glucosio dal lume prossimale dell'intestino tenue alla circolazione.

Nel complesso, questi studi suggeriscono che l'assorbimento intestinale del glucosio lungo il tratto gastrointestinale sia dal flusso sanguigno che dal lume intestinale è fondamentale per la capacità di abbassare il glucosio della metformina.

Pertanto, l'intestino potrebbe agire prevalentemente come un pozzo di glucosio attraverso l'assorbimento di glucosio da parte degli enterociti in risposta all'azione della metformina.  

In questo contesto, il contributo dell'espressione di GLUT2 sulla superficie basolaterale e sulla superficie apicale degli enterociti che è innescato dalla metformina, possibilmente attraverso un meccanismo AMPK-dipendente, è coerente con la risposta glicemica modificata alla metformina dei pazienti che esprimono una particolare variante di GLUT2.

Allo stesso modo, l'espressione di GLUT1 indotta da metformina nel colon e nell'ileo, secondaria all'aumentata espressione del fattore di trascrizione attivante, potrebbe anche contribuire all'assorbimento di glucosio intestinale basolaterale mediato da metformina nei topi alimentati con HFD.

Dopo l'assorbimento negli enterociti, il metabolismo anaerobico del glucosio ha provocato l'accumulo di lattato e acetato nella parete dell'intestino tenue e il rilascio in circolo; Questo risultato è supportato da dati preclinici e studi clinici.  

Produzione intestinale di lattato e acetato: Crosstalk intestino-fegato

La produzione intestinale di lattato e acetato stabilisce un crosstalk intestino-fegato per attenuare la produzione di glucosio epatico, possibilmente attraverso la riduzione dell'attività della piruvato carbossilasi epatica riducendo il pH nella vena porta (una conseguenza dell'aumento del lattato) e dei vettori mitocondriali epatici del piruvato 1 e 2 mediante acetilazione (una conseguenza dell'aumento dell'acetato).

La produzione intestinale di lattato potrebbe anche partecipare a un ciclo inutile intestino-fegato che si traduce in un aumento del dispendio energetico durante il trattamento a lungo termine con metformina, che è stato riportato nei topi alimentati con HFD.

Tessuto adiposo bruno. Il tessuto adiposo bruno (BAT) è un organo altamente metabolicamente attivo ed è ben noto per il suo ruolo termogenico dissipando l'energia in calore. Tuttavia, un numero crescente di studi ha dimostrato che il BAT contribuisce alla regolazione dell'omeostasi del glucosio in tutto il corpo ed è stato suggerito che il BAT potrebbe essere un bersaglio terapeutico nel trattamento e nella prevenzione del diabete di tipo 2.

Utilizzando l'imaging PET con 11C-metformina, è stato dimostrato l'assorbimento di metformina nel deposito interscapolare di BAT di topi, il che supporta l'ipotesi che la BAT potrebbe essere un bersaglio della metformina.

Organelli bersaglio della metformina

Sin dai primi anni 2000, i mitocondri sono stati considerati i classici organelli bersaglio per l'azione ipoglicemizzante della metformina, basata sull'arricchimento della matrice e sull'inibizione specifica, lieve e reversibile del complesso I26 della catena respiratoria mitocondriale.

 Targeting della funzione del tessuto adiposo bruno

 L'analisi della biodistribuzione della metformina nei topi ha rivelato l'assorbimento e l'accumulo nel deposito di tessuto adiposo bruno interscapolare (BAT) attraverso l'assorbimento mediato da OCT3, a livelli simili a quelli nel rene e nell'intestino.  

Il trattamento con metformina ha aumentato l'espressione dei marcatori di proliferazione e differenziazione cellulare negli adipociti bruni, insieme all'aumento della massa BAT224. La metformina ha aumentato l'espressione del dominio PR co-regolatore trascrizionale contenente 16, un marcatore di differenziazione degli adipociti bruni, e ha salvato la massa e la funzionalità di BAT nella prole di topi femmina obesi.

La metformina è riconosciuta come bersaglio diretto del metabolismo degli adipociti bruni, contribuendo a un miglioramento indotto dalla metformina nel profilo lipidico del sangue attraverso l'aumento della clearance dei trigliceridi VLDL nei topi.  

Aumento dell’ attività della lipasi ormone-sensibile e della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK) 

Aumentando le attività della lipasi ormone-sensibile e della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK), la metformina promuove la lipolisi dei trigliceridi intracellulari e l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali nelle BAT.

La metformina sovraregola anche gli enzimi coinvolti nell'ossidazione degli acidi grassi e aumenta l'espressione dei geni correlati alla termogenesi adattativa nel BAT nei roditori, ma ha un effetto limitato sul dispendio energetico nella maggior parte degli studi sull'uomo e sugli animali. 

Asse AMPK-microbiota intestinale-BAT intestinale

È interessante notare che i risultati hanno sottolineato l'importanza di un asse AMPK-microbiota intestinale-BAT intestinale per la regolazione della funzione BAT della metformina.  

L'evidenza supporta l'ipotesi che l'AMPK nell'intestino sia necessario per l'azione della metformina sull'attività termogenica del BAT modulando il microbiota intestinale e diminuendo i livelli circolanti del metabolita batterico metilgliossale nei topi.  

Il beneficio terapeutico della metformina è stato esaminato anche nel contesto della meta-infiammazione BAT, evidenziando i suoi effetti antinfiammatori attraverso la regolazione dell'interattoma tra macrofagi e adipociti bruni nei topi.  

La metformina ha alleviato l'infiammazione promuovendo la degradazione di HIF1α a seguito di una riduzione indotta dalla metformina del consumo di ossigeno nei macrofagi nel BAT dei topi.  

La metformina ha attenuato le cascate di segnalazione pro-infiammatorie mediate dai macrofagi negli adipociti bruni e ha ripristinato la reattività di BAT all'esposizione al freddo nei topi obesi.  

Questi risultati illustrano gli effetti protettivi della metformina sulla funzione del BAT e potrebbero essere di rilevanza terapeutica per alleviare la disfunzione del BAT nei disturbi metabolici. 

Legame dei chinoni (canale Q)

Il principale sito inibitorio è localizzato nella regione anfipatica del canale di legame dei chinoni (canale Q), adiacente ad un elemento strutturale mobile nella subunità NDUFS7;  

Quando una biguanide si lega a questo sito, viene impedita la riattivazione dello stato enzimatico disattivato, come riportato in precedenza.

Questi dati strutturali ottenuti utilizzando una molecola sintetica simile a una biguanide supportano un effetto specifico sul complesso I.

Da notare, vale la pena ricordare che l'inibizione della glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale (mGPDH) e del complesso IV della catena respiratoria mitocondriale sono stati suggeriti come meccanismi alternativi dell'azione della metformina, secondo studi condotti sui roditori.  

Tuttavia, gli argomenti a sostegno di un ruolo per questi altri siti mitocondriali putativi di azione della metformina rimangono molto dibattuti.

Infine, l'identificazione di proteine leganti la metformina associate a lisosomi isolati in cellule umane e murine evidenzia i lisosomi come un bersaglio funzionale alternativo o aggiuntivo della metformina. 

Meccanismi AMPK-dipendenti e AMPK-indipendenti

Inizialmente, si pensava che la metformina agisse principalmente attraverso l'attivazione della via di segnalazione LKB1-AMPK.  

L'attivazione dell'AMPK indotta dalla metformina può avvenire attraverso le vie di attivazione dell'AMPK dipendenti e indipendenti dall'AMP che sono correlate alle concentrazioni di metformina utilizzate e agli organelli bersaglio (mitocondri o lisosomi).

Tuttavia, sono stati ampiamente documentati anche meccanismi di azione della metformina indipendenti dall'AMPK.

Da notare che l'effetto ipoglicemizzante acuto della metformina è preservato in modelli murini knockout per AMPK specifici per il fegato, per l'intestino e per il muscolo scheletrico, il che indica che almeno alcuni effetti diretti della metformina sono indipendenti dall'AMPK.  

Al contrario, l'AMPK intestinale è necessario per gli effetti terapeutici della somministrazione cronica di metformina nei topi alimentati con HFD.  

Anche se l'attivazione dell'AMPK indotta da metformina non inibisce direttamente la gluconeogenesi epatica, l'effetto della somministrazione cronica di metformina potrebbe migliorare indirettamente la capacità dell'insulina di abbassare la produzione di glucosio epatico a seguito di una riduzione AMPK-dipendente della resistenza all'insulina indotta dai lipidi epatici.  

A sostegno di questa ipotesi, le compromissioni degli effetti ipoglicemizzanti e ipolipemizzanti della somministrazione cronica di metformina nei topi sono state associate a una compromissione della segnalazione dell'AMPK.  

Infine, per determinare gli eventi di fosforilazione indotti dalla metformina indipendentemente dalla via di segnalazione LKB1-AMPK, è stato condotto un approccio proteomico quantitativo basato sull'arricchimento selettivo degli interattori della proteina fosfo-scaffolding, in topi knockout LKB1-knockout e AMPK-knockout epatici specifici in risposta alla somministrazione acuta di metformina.

Circa la metà degli eventi di fosforilazione erano indipendenti dalla segnalazione LKB1-AMPK, indicando che altre chinasi dello stress attivate in modo acuto dalla metformina potrebbero partecipare all'azione pleiotropica del farmaco. 

Nuovi meccanismi ipoglicemizzanti della metformina 

L'effetto antidiabetico della metformina è mediato principalmente attraverso l'inibizione della gluconeogenesi epatica; tuttavia, prove emergenti suggeriscono che anche il tratto gastrointestinale ha un ruolo nell'azione ipoglicemizzante della metformina.  

È ampiamente accettato che la metformina colpisca i mitocondri epatici e inibisca il complesso I della catena respiratoria mitocondriale;

L'inibizione è reversibile e debole.  

Questa inibizione porta ad una moderata diminuzione della sintesi di ATP mediante fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) e ad un aumento del rapporto AMP/ATP negli epatociti.  

Di conseguenza, poiché la gluconeogenesi è una costosa via metabolica ATP-dipendente, la riduzione della carica energetica cellulare potrebbe essere sufficiente a spiegare la diminuzione del flusso gluconeogenico epatico.  

Inoltre, il lieve aumento dei livelli intracellulari di AMP indotto dalla metformina porta all'inibizione degli enzimi regolati da AMP coinvolti nella gluconeogenesi epatica (come la fruttosio-1,6-bisfosfatasi e l'adenilato ciclasi), che contribuisce a una diminuzione della produzione epatica di glucosio e all'attivazione del sensore di energia cellulare AMPK;  

tuttavia, l'attivazione dell'AMPK non ha alcun effetto diretto sulla produzione di glucosio.  

La rilevanza fisiologica di questi meccanismi è stata messa in discussione a causa dell'uso di concentrazioni sovrafarmacologiche (millimolari) di metformina negli studi.

In effetti, gli studi hanno dimostrato che le concentrazioni di metformina clinicamente rilevanti (micromolari) sopprimono la produzione di glucosio negli epatociti primari di topo attraverso meccanismi indipendenti da cambiamenti apparenti nei livelli di nucleotidi di adenina. 

Azione sui Lisosomi: PEN2-asse ATP6AP1 lisosomiale 

E' stato riportato che, negli epatociti primari di topo, basse concentrazioni di metformina attivano l'AMPK nei lisosomi attraverso un meccanismo indipendente dall'AMP che coinvolge il reclutamento di un complesso composto da AXIN e dalla chinasi a monte LKB1 sulla superficie dei lisosomi attraverso l'aggancio al complesso vacuolare H+-ATPasi (v-ATPasi)-Ragulator.  

In questo modello, la metformina a basse dosi ha inibito la v-ATPasi nei lisosomi, che funge da sensore di basse concentrazioni di metformina.  

In uno studio pubblicato nel 2022, l'enhancer 2 della proteina di membrana presenilina (PEN2; una subunità del complesso γ-secretasi) è stato identificato come partner della metformina.  

In particolare, la metformina a concentrazioni fino a 5 μM potrebbe innescare una robusta attivazione dell'AMPK sia nel topo primario che negli epatociti umani dopo solo 2 ore di trattamento, il che contrasta con altri rapporti secondo cui concentrazioni

Azione a livello molecolare 

A livello molecolare, i residui di fenilalanina-35 (F35), glutammato-40 (E40) e tirosina-47 (Y47) di PEN2 sono fondamentali per legarsi alla metformina, poiché questi residui interagiscono con il gruppo biguanide della molecola.

PEN2 legato alla metformina viene quindi reclutato in ATP6AP1, una proteina accessoria della v-ATPasi, che porta all'inibizione della v-ATPasi e all'attivazione di AMPK sulla superficie del lisosoma senza alterare i livelli cellulari di AMP.  

Azione molecolare ad alte dosi (>100 μM)

Da notare che la metformina ad alte dosi (>100 μM) ha bypassato il requisito della segnalazione PEN2-ATP6AP1 per l'attivazione dell'AMPK sulla superficie del lisosoma, perché alte dosi di metformina aumentano i livelli intracellulari di AMP.  

In termini di risposta fisiologica, la delezione intestina-specifica di PEN2 nei topi ha alterato i miglioramenti nella tolleranza al glucosio associati alla secrezione di GLP1 in risposta alla metformina.

Tuttavia, non è chiaro se questi effetti siano mediati dalla segnalazione di PEN2-AMPK in enterociti esposti a concentrazioni di metformina molto superiori a 5 μM.  

Inoltre, l'ablazione di PEN2 nel fegato ha abolito la riduzione indotta dalla metformina del contenuto lipidico epatico nei topi alimentati con HFD, supportando l'ipotesi che la metformina possa sopprimere indirettamente la gluconeogenesi a lungo termine attraverso una riduzione AMPK-dipendente della resistenza all'insulina indotta dai lipidi.  

Tuttavia, la rilevanza di questo meccanismo nell'uomo è discutibile in quanto la metformina non ha un'efficacia sostanziale nel trattamento del fegato grasso nei pazienti con steatosi epatica non alcolica.

È interessante notare che, in risposta a basse concentrazioni di metformina, l'asse PEN2-ATP6AP1 porta all'attivazione del pool AMPK nei lisosomi. 

Metformina zione sul fegato

Nel fegato, la metformina induce una lieve inibizione del complesso I, della catena respiratoria mitocondriale, portando a una moderata diminuzione della sintesi di ATP e a un concomitante aumento dei livelli cellulari di AMP.  

La diminuzione indotta dalla metformina del flusso gluconeogenico epatico, un processo metabolico dipendente dall'ATP, potrebbe derivare da questa riduzione dei livelli di ATP.

Inoltre, l'aumento dei livelli di AMP porta all'inibizione dell'attività degli enzimi che sono regolati dall'AMP e sono coinvolti nella gluconeogenesi, come l'adenilato ciclasi e la fruttosio-1-6-bisfosfatasi (FBP1), che contribuisce alla diminuzione della produzione di glucosio.

Da notare che l'aumento indotto dalla metformina del rapporto AMP/ATP attiva anche la proteina chinasi attivata da AMP (AMPK), ma questo non ha alcun effetto diretto sulla regolazione della produzione di glucosio.  

L'inibizione del complesso I da parte della metformina è accompagnata anche da un aumento del potenziale redox cellulare (NADH:NAD+).  

Al centro: meccanismi dipendenti dalla glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale (mGPDH) e meccanismi dipendenti dall'inibizione del complesso IV.

La metformina inibisce direttamente l'mGPDH, determinando un aumento dello stato redox citosolico (NADH:NAD+), una riduzione della gluconeogenesi da lattato e una riduzione dell'attività della navetta glicerolo-fosfato (che trasferisce il NADH dal citosol ai mitocondri).  

Aumento del Glutatione

Inoltre, la metformina aumenta lo stato redox epatico attraverso un aumento del rapporto glutatione/glutatione ossidato (GSH:GSSG), portando all'inibizione dei geni che codificano enzimi coinvolti nella gluconeogenesi attraverso una via let-7-TET3-HNF4α.  

Infine, la metformina inibisce il complesso IV della catena respiratoria mitocondriale, che può anche provocare un'inibizione indiretta dell'attività di mGPDH.  

La metformina a basse concentrazioni lega l'enhancer 2 della presenilina (PEN2), che viene reclutato nella proteina accessoria 1 (ATP6AP1) trasportatrice dell'ATPasi H+ indipendentemente dalle variazioni dei livelli di AMP, portando all'inibizione della v-ATPasi e alla fosforilazione e/o all'attivazione dell'AMPK nei lisosomi attraverso la formazione di un supercomplesso contenente la v-ATPasi, Ragulator, AXIN, la chinasi epatica B1 (LKB1) e l'AMPK.

Successivamente, l'AMPK attivato dalla metformina dai lisosomi riduce l'accumulo di lipidi nel fegato attraverso l'inibizione dell'acetil-CoA carbossilasi (ACC) e aumenta la secrezione del peptide 1 simile al glucagone (GLP1) nell'intestino, inducendo riduzioni dei livelli ematici di glucosio. cGPDH, glicerolo-3-fosfato deidrogenasi citosolica; HNF-4α, fattore nucleare 4α dell'epatocita; LDH, lattato deidrogenasi; OCT1, trasportatore organico 1; TET3, Tet metilcitosina diossigenasi 3, negli epatociti primari senza interessare altri pool di AMPK, come quelli del reticolo endoplasmatico (ER) e dei mitocondri36.

Da notare che non è chiaro come l'AMPK ancorato alla superficie del lisosoma possa fosforilare il suo bersaglio lipogenico acetil-CoA carbossilasi e inibire la lipogenesi, che avviene nel citoplasma e nel reticolo endoplasmatico, per ridurre infine il contenuto lipidico epatico.

Infine, l'abbattimento di PEN2 o ATP6AP1 in Caenorhabditis elegans ha abrogato l'estensione della durata della vita indotta dalla metformina.

Tuttavia, questi esperimenti sono stati condotti utilizzando concentrazioni estremamente elevate di metformina (50 mM) che sono 10.000 volte superiori a quelle utilizzate in vitro (5 μM).  

Il modello lisosomiale metformina-PEN2 solleva altre questioni essenziali sul meccanismo d'azione della metformina. In particolare, questo modello suggerisce che gli effetti ipoglicemizzanti della metformina si verificano attraverso l'AMPK nell'intestino, ma non spiega come basse concentrazioni di metformina inibiscano direttamente la produzione acuta di glucosio epatico, che è chiaramente indipendente dall'AMPK.

Mitocondri: Glicerol-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale

Altri meccanismi che coinvolgono cambiamenti nello stato redox epatico, ma indipendenti dai cambiamenti nei livelli di nucleotide adenina e nell'attivazione dell'AMPK, sono stati proposti per spiegare l'inibizione della produzione epatica di glucosio in risposta a basse concentrazioni di metformina.  

Gli equivalenti riducenti citosolici (NADH) prodotti dal metabolismo intermedio vengono trasferiti dal citosol ai mitocondri attraverso sistemi navetta NADH per essere ossidati dalla catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC) per generare ATP.  

Sistemi shuttle malato-aspartato e glicerolo-fosfato

La navetta malato-aspartato e la navetta glicerolo-fosfato sono i due principali sistemi navetta redox che mantengono l'equilibrio redox tra i compartimenti citosolico e mitocondriale.  

Concentrazioni clinicamente rilevanti di metformina aumentano il rapporto NADH/NAD+ citosolico epatico (rapporto lattato/piruvato) indipendentemente dalle variazioni dei livelli intracellulari di ATP, che si traduce nell'inibizione della produzione di glucosio da substrati gluconeogenici ridotti (lattato e glicerolo) ma non da substrati ossidati (alanina e piruvato).

È stato ipotizzato che l'aumento dello stato redox citosolico indotto dalla metformina sia mediato dall'inibizione diretta dell'attività di mGPDH.  

mGPDH

mGPDH si trova sul lato esterno della membrana interna e, con il suo partner citosolico cGPDH, costituisce una navetta glicerolo-fosfato.

Tuttavia, questo modello di inibizione dell'mGPDH indotta dalla metformina solleva alcuni problemi.  

La navetta malato-aspartato è la principale navetta del NADH nel fegato e l'inibizione della navetta glicerolo-fosfato potrebbe essere insufficiente per ridurre la gluconeogenesi.  

Infatti, i topi privi della navetta glicerolo-fosfato mostrano livelli normali di glucosio nel sangue a digiuno, mentre i topi privi della navetta malato-aspartato hanno livelli ematici ridotti di glucosio e un aumento del rapporto citosolico NADH/NAD+.  

Sebbene molti studi abbiano dimostrato che basse dosi di metformina causano un aumento del rapporto citosolico tra NADH e NAD+, diversi studi non hanno riscontrato una diminuzione della produzione di glucosio dal lattato o un'inibizione diretta dell'attività di mGPDH in risposta alla metformina.

Pertanto, un corpo di prove mette in dubbio se mGPDH sia un bersaglio molecolare diretto per la metformina. 

Complesso della catena respiratoria mitocondriale IV

Concentrazioni clinicamente rilevanti di metformina inibiscono l'attività del complesso IV, con conseguente inibizione dell'attività di mGPDH, un aumento dello stato redox citosolico e una riduzione della gluconeogenesi epatica.

In questo nuovo meccanismo proposto, è stato postulato che l'inibizione del complesso IV da parte della metformina blocchi l'ETC, portando all'inibizione indiretta dell'attività di mGPDH attraverso una diminuzione del pool di ubichinone, che è l'accettore di elettroni di mGPDH.  

L'interazione tra metformina e complesso IV potrebbe essere guidata dalla capacità delle biguanidi di legare ioni metallici, come ferro e rame, che sono entrambi presenti nel complesso IV.  

Tuttavia, tutti i complessi dell'ETC contengono ioni ferro e/o rame, che sono essenziali per il trasferimento di elettroni, rendendo quindi improbabile che la metformina colpisca specificamente il complesso IV in questo modo.

Nel complesso, la preoccupazione fondamentale con l'ipotesi dell'inibizione del complesso IV indotta dalla metformina è che postula un aumento del potenziale redox senza compromissione della carica energetica cellulare, che va contro il processo bioenergetico OXPHOS.  

Infatti, l'interruzione dell'ETC attraverso l'inibizione del complesso IV da parte della metformina avrebbe presumibilmente, come l'inibizione del complesso I, un impatto sulla sintesi di ATP dipendente dal potenziale redox, portando a una diminuzione dei livelli cellulari di ATP.

Da notare che i primi studi che hanno suggerito che la metformina induce l'inibizione del complesso I hanno mostrato simultaneamente un aumento del rapporto AMP/ATP e del rapporto NADH/NAD+. 

Vale la pena notare che il concetto di collegare l'inibizione del complesso I da parte della metformina alla soppressione del flusso gluconeogenico che richiede energia è stato screditato perché basse concentrazioni del farmaco reprimono la produzione di glucosio negli epatociti indipendentemente da qualsiasi cambiamento rilevabile nel rapporto AMP/ATP.

In particolare, l'uso dell'AMPK come sonda sensibile per valutare sottili cambiamenti nel rapporto AMP/ATP ha rivelato cambiamenti dipendenti dalla metformina nella carica energetica cellulare che non sono rilevabili con altri metodi.  

Pertanto, una riduzione della carica energetica dipendente dall'inibizione del complesso I non può essere esclusa come causa dell'inibizione della gluconeogenesi epatica in risposta a basse concentrazioni di metformina. 

MicroRNA Let-7

In linea con gli effetti redox della metformina, uno studio ha suggerito che concentrazioni clinicamente rilevanti di metformina potrebbero inibire la gluconeogenesi epatica attraverso la regolazione trascrizionale redox-dipendente.  

Meccanicisticamente, la metformina induce l'espressione del microRNA let-7 in modo redox-dipendente attraverso un aumento del rapporto glutatione ridotto a glutatione ossidato (GSH a GSSG).

A sua volta, let-7 sottoregola TET3 e cambia il rapporto delle isoforme di HNF-4α, portando all'inibizione dell'espressione dei geni che codificano enzimi coinvolti nella gluconeogenesi.  

Tuttavia, questo meccanismo non può spiegare la riduzione acuta del flusso gluconeogenico indotta dalla metformina, in cui il farmaco può inibire la produzione epatica di glucosio in assenza di cambiamenti trascrizionali nel programma gluconeogenico.